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  • 201212-29
    用scFv接頭PCR裝配VH和VL進(jìn)行scFv基因文庫(kù)的構(gòu)建

    [方法]1.在0.5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應(yīng)混合液。配制成2個(gè)“反應(yīng)管”,1個(gè)含有V。文庫(kù)DNA,另1個(gè)則含有Vl文庫(kù)DNA。反應(yīng)管對(duì)照1對(duì)照2●scFV接頭DNA(100ng/ul)1.0ul1.0ul●VH文庫(kù)DNA(100ng/ul)3.5ul1.0ul●V-文庫(kù)DNA(Vκ或Vλ)(100ng/ul)3.0ul1.0ul●水6.5ul5.5ul2.在每管中加入:●水,33ul●10×Vent緩沖液,5.0ul●20×dNTP,2.5ul3.在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱...

  • 201212-29
    再擴(kuò)增scFv基因文庫(kù)以添加限制性位點(diǎn)進(jìn)行克隆

    [方法]1.在0.5ml微量離心管中,配制兩個(gè)50/z1PCR反應(yīng)混合液(1個(gè)用于VH—VκscFv文庫(kù),另1個(gè)用于Vu—VλscFv文庫(kù)),其中含有:●水,36.5//1●10XTag緩沖液,5.0ul●20XdNTP,2.5ul●正向引物,2.0ul●反向引物,2.0ul●scFv基因文庫(kù)(約long),1.0ul2.在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃,5分鐘。如果沒(méi)有加熱蓋,則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。3.加入1.0ul(5單位)TdQDNA聚合酶。4.以94℃1分鐘...

  • 201212-29
    對(duì)scFv基因文庫(kù)及pHEN1噬菌體展示栽體的限制性消化

    [方法]1,配制兩個(gè)100ulPCR反應(yīng)混合液來(lái)消化scFV文庫(kù),其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫(kù),另1個(gè)用于VH-VλscFv文庫(kù),該混合液含有:●scFVDNA(1~4ug),50ul●水,33ul●10×NEB3緩沖液,10ul●乙酰BSA(100×),1.0ul●Nco工(10U/ul),3.0f11●NoJ工(10U/ul),3.0ul2.37℃孵育反應(yīng)液過(guò)夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置,防止水分蒸發(fā)?;蛘撸梢园碢CR反應(yīng)那樣加一層礦物油(Sigma...

  • 201212-27
    電轉(zhuǎn)化連接物構(gòu)建抗體文庫(kù)

    [方法]1.將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D(電阻)、25rtF(電容)和2.5kV。2.在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。3.將80ng已純化且無(wú)鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4.將混合物轉(zhuǎn)移至0.2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中,小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯,使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5.將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi),確保小杯側(cè)面干燥(以免電?。?。啟動(dòng)脈沖,立即加入1.0ml...

  • 201212-27
    制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體

    抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中制備噬菌體。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前,先用滴定法(在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板)計(jì)算每毫升抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm(A600)處的某個(gè)特定吸光值下,抗體文庫(kù)中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因?yàn)楹匈|(zhì)粒的文庫(kù)細(xì)菌體積更大,或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系,吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計(jì)算。對(duì)于噬菌體的制備(文庫(kù)救援),來(lái)自文庫(kù)儲(chǔ)存料的起始接種量應(yīng)比文庫(kù)容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后,細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過(guò)0.05。采用文庫(kù)容...

  • 201212-25
    用氯化銫離心法純化噬菌體

    1.在每毫升zui后的噬菌體懸液(例如來(lái)自實(shí)驗(yàn)方案13.11)中,加入0.45g氯化銫,充分混勻至溶解。2.用吊桶式轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)男吞?hào))離心溶液,15℃17h,噬菌體將濃縮在組分1和組分2中(。組分1的濃度較高,但組分2的體積較大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取這些組分。如果是*次使用本實(shí)驗(yàn)方案,那么先收集所有條帶并分別對(duì)其檢測(cè)將是明智之舉。3.將收獲的溶液對(duì)PBS透析過(guò)夜。4.通過(guò)感染大腸桿菌DH5cF,或TGl滴定各個(gè)不同組分中噬菌體,并保存滴度zui高的組分。通常,噬菌...

  • 201212-25
    從噬菌體文庫(kù)選擇抗原特異性抗體

    從噬菌體抗體文庫(kù)中分離抗原特異性抗體,是通過(guò)讓噬菌體進(jìn)入到在抗原上進(jìn)行的重復(fù)性選擇循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。理想情況下,僅需l輪選擇即可完成。但事實(shí)是,絲狀噬菌體常常非特異性地結(jié)合到支持物表面,從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實(shí)際上,需要2~5輪的選擇?,F(xiàn)在已設(shè)計(jì)了許多各自不同的選擇方法;其中包括在固相支持物上包被抗原進(jìn)行生物淘選,使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片,用生物素化抗原選擇E37J,多肽E383,在固定的原核生物E393或哺乳動(dòng)物E403細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞E41-4...

  • 201212-22
    在微量滴定板中進(jìn)行可溶性SCFv ElISA的方法

    1.按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板,4℃過(guò)夜。PBS中10ug/m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時(shí)需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液(比如碳酸鹽緩沖液)。2.棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3.加入200gl的2%MPBS封閉每個(gè)板孔,37℃孵育2小時(shí)。4.用PBS洗滌板孔3次。5.每孔加入50ul的4%MPBS。6.每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清,用移液器反復(fù)吹吸混勻,室溫孵育1小時(shí)。7.棄去溶液,用PBS/Tween洗滌板孔3次,再用PBS洗滌3次...

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