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[方法]1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應(yīng)混合液。配制成2個(gè)“反應(yīng)管”，1個(gè)含有V。文庫(kù)DNA，另1個(gè)則含有Vl文庫(kù)DNA。反應(yīng)管對(duì)照1對(duì)照2●scFV接頭DNA（100ng/ul）1．0ul1．0ul●VH文庫(kù)DNA（100ng/ul）3．5ul1．0ul●V-文庫(kù)DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul）3．0ul1．0ul●水6．5ul5．5ul2．在每管中加入：●水，33ul●10×Vent緩沖液，5．0ul●20×dNTP，2．5ul3．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱...
[方法]1．在0．5ml微量離心管中，配制兩個(gè)50/z1PCR反應(yīng)混合液（1個(gè)用于VH—VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于Vu—VλscFv文庫(kù)），其中含有：●水，36．5//1●10XTag緩沖液，5．0ul●20XdNTP，2．5ul●正向引物，2．0ul●反向引物，2．0ul●scFv基因文庫(kù)（約long），1．0ul2．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃，5分鐘。如果沒(méi)有加熱蓋，則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。3．加入1．0ul（5單位）TdQDNA聚合酶。4．以94℃1分鐘...
[方法]1，配制兩個(gè)100ulPCR反應(yīng)混合液來(lái)消化scFV文庫(kù)，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于VH-VλscFv文庫(kù)，該混合液含有：●scFVDNA（1～4ug），50ul●水，33ul●10×NEB3緩沖液，10ul●乙酰BSA（100×），1．0ul●Nco工（10U/ul），3．0f11●NoJ工（10U/ul），3．0ul2．37℃孵育反應(yīng)液過(guò)夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置，防止水分蒸發(fā)?；蛘撸梢园碢CR反應(yīng)那樣加一層礦物油（Sigma...
[方法]1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。3．將80ng已純化且無(wú)鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電?。?。啟動(dòng)脈沖，立即加入1．0ml...
抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中制備噬菌體。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計(jì)算每毫升抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個(gè)特定吸光值下，抗體文庫(kù)中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因?yàn)楹匈|(zhì)粒的文庫(kù)細(xì)菌體積更大，或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計(jì)算。對(duì)于噬菌體的制備（文庫(kù)救援），來(lái)自文庫(kù)儲(chǔ)存料的起始接種量應(yīng)比文庫(kù)容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過(guò)0．05。采用文庫(kù)容...
1．在每毫升zui后的噬菌體懸液（例如來(lái)自實(shí)驗(yàn)方案13．11）中，加入0．45g氯化銫，充分混勻至溶解。2．用吊桶式轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)男吞?hào)）離心溶液，15℃17h，噬菌體將濃縮在組分1和組分2中（。組分1的濃度較高，但組分2的體積較大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取這些組分。如果是*次使用本實(shí)驗(yàn)方案，那么先收集所有條帶并分別對(duì)其檢測(cè)將是明智之舉。3．將收獲的溶液對(duì)PBS透析過(guò)夜。4．通過(guò)感染大腸桿菌DH5cF，或TGl滴定各個(gè)不同組分中噬菌體，并保存滴度zui高的組分。通常，噬菌...
從噬菌體抗體文庫(kù)中分離抗原特異性抗體，是通過(guò)讓噬菌體進(jìn)入到在抗原上進(jìn)行的重復(fù)性選擇循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。理想情況下，僅需l輪選擇即可完成。但事實(shí)是，絲狀噬菌體常常非特異性地結(jié)合到支持物表面，從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實(shí)際上，需要2～5輪的選擇?，F(xiàn)在已設(shè)計(jì)了許多各自不同的選擇方法；其中包括在固相支持物上包被抗原進(jìn)行生物淘選，使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片，用生物素化抗原選擇E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳動(dòng)物E403細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞E41-4...
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過(guò)夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時(shí)需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封閉每個(gè)板孔，37℃孵育2小時(shí)。4．用PBS洗滌板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復(fù)吹吸混勻，室溫孵育1小時(shí)。7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次...
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